对微生物育种来说,有性重组的局限性很大,这是因为迄今发现的具有杂交过程的生命现象的微生物并不多,这就妨碍了基因重组在微生物育种中的普遍应用。原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组和杂交的方法。原生质体融合技术首先是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的,然后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于这一技术可以打破种属间的界限,提高重组频率,矿大重组幅度,而备受关注。
一,原生质体融合的优越性
原生质体融合的方法是首先用生物酶分别酶解两个出发菌属的细胞壁,在高渗环境中释放出原生质,将两个出发菌株的原生质体混合,在助溶剂或电厂作用下,使它们互相凝集,发生细胞融合,实现遗传种族。
二,原生质体融合方法
原生质体融合技术的一般程序包括原生质体的制备、肢体的再生和融合子的筛选等步骤。
1,原生质体制备 施用各种酶解两个出发菌株的细胞壁,使其细胞壁消化或部分破裂,释放出原生质体,为防止原生质体内不渗透压过高而破裂,必须将原生质体释放到高渗溶液中。由于各种微生物细胞壁的组成不同,须采用不同的原生质体制备方法。
2,原生质体融合和再生 两个出发菌株制备好的原生质可以通过化学因子或电厂诱导的方法进行融合。化学因子诱导多采用聚乙二醇4000和聚乙二醇6000作为融合及,并加入二价钙和二价镁等阳离子。电融合过程是原生质体在电厂中极化成偶极子,并沿电力线方向排列成串,再加直流脉冲击穿原生质体膜,导致原生质体发生融合。
融合后的原生质体具有生物活性,氮由于缺少细胞壁,不是正常的细胞,不能在普通培养基上生长,所以要涂布在高渗培养基上使融合子的细胞壁再生,可以通过增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖来增加再生率。
三,融合子的检出
融合子可以在选择培养基上检出,即通过两个遗传标记互补来选择,如利用营养缺陷型互补在基本培养基上识别融合子。此外可以利用荧光染色,将两个亲株用不同的荧光色素染色,融合后再有荧光装置的立体显微镜下观察融合子,如果在一个个体上观察到双亲的两种荧光色素,即为融合子。
通过上述方法产生的融合子如果产生了杂合双倍体或单倍重组子,其遗传性状比较稳定。但也可能产生的融合是一种短暂的融合,会再次分离成亲本遗传型。所以还要再进行多次筛选,找到稳定的融合子。